【通关监管】海关技术规范解读 | 国境口岸恙虫病东方体实时荧光PCR检测方法

2021年6月18日，中华人民共和国海关总署发布了2021年第45号公告。关于《进口再生钢铁原料检验规程》等76项行业标准发布，其中《国境口岸恙虫病东方体实时荧光PCR检测方法》SN/T 5332-2021自2022年1月1日起实施，本文对该行业标准进行解读。

海关总署公告2021年第45号及附件

一、恙虫病是什么

恙虫病由恙虫病东方体引起，以鼠类为主要传染源的自然疫源性疾病。临床上以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为特征。我国古代称恙虫病为沙虱热，广东称为元宝疮、爪子疮，福建平潭称三阳病，浙江永嘉称杨梅病、六月客等。

自我国广东省报告首例恙虫病病例以来，恙虫病疫区已由海南、广东、福建、浙江等省区扩展到山东、江苏、山西、黑龙江、吉林、辽宁以及天津等省市。2006年报告恙虫病病例数1244例；2007年报告1332例、死亡1例；2008年报告2592例、死亡3例，恙虫病流行呈上升趋势。研究表明，已有10属21种鼠类自然感染恙虫病东方体，恙虫病已经成为我国重要的鼠源性自然疫源性疾病，对人类健康构成极大威胁。

二、检测对象是什么

本标准检测对象包括国境口岸及出入境交通工具、集装箱、货物、行李等场所采集的鼠类样品，国境口岸疑似恙虫病患者的临床样品。

鼠类是出入境交通工具中常见的病媒生物之一，可随飞机、轮船等载体在国境口岸之间扩散。历史上多次发生由于鼠类入境造成疫病暴发流行的事例。1898年，一艘汽船将染有鼠疫耶尔森菌的褐家鼠（Rattus norvegicus）从印度带到了马达加斯加岛，褐家鼠在该岛大量繁殖，使当地鼠疫频繁发生。近年来，我国卫生检疫机构在北京、上海、宁波、成都等口岸的入境飞机、轮船、集装箱中查获大量的鼠类。

鼠类的输入对我国国境口岸的卫生安全构成严重威胁，国境口岸是防范病媒生物输入的第一道防线。加强对出入境交通工具及集装箱、货物等的排查和对输入性鼠类携带病原体的监测检测，是有效防止传染病通过口岸输入、输出，避免疫情大范围暴发的基础和前提，也是国境口岸检疫执法和疾病监测的迫切需要。

三、本标准中检测方法

本标准采用实时荧光PCR检测方法对待检样品进行检测。参考恙虫病东方体Karp、Gilliam、Kato血清型56-kDa蛋白基因序列，设计并合成上下游引物及Taqman-MGB探针，扩增片段大小为130 bp。

以Karp型基因序列（GI:63079111）为例，对引物扩增区域核酸序列分别向两侧外延，构建质粒作为阳性对照。适当稀释，当检测Ct值在20~35之间，进行分装备用。

序列如下：

GAAAAAAATTATGTTAATTGCTAGTGCAATGTCTGCGTTGTCGTTGCCATTTTCAGCTAGTGCAATAGAATTGGGGGAAGAAGGATTAGAGTGTGGTCCTTATGCTAAAGTTGGAGTTGTTGGAGGAATGATTACTGGCGTAGAATCTGCTCG。

四、标准方法检测条件及系统评价情况

实时荧光PCR反应体系

以LightCycler 480I 型实时荧光定量PCR仪器为例，反应条件如下：

50 ℃ 2分钟；95 ℃ 10分钟；95 ℃ 15 秒，60 ℃ 1分钟，循环45次，退火时收集荧光信号。荧光通道为FAM。由于不同实时荧光定量PCR仪性能有差异，可根据实际仪器型号，对检测程序略作调整。

1

敏感性及线性评价情况

本标准提供的恙虫病东方体实时荧光定量PCR检测方法，定量关系曲线线性拟合系数R²=0.9988，检测敏感性为54.5个拷贝。

敏感性扩增曲线图

定量关系曲线

2

特异性及重复性评价

本标准提供检测方法与莫氏立克次体（R.mooseri）、普氏立克次体(R.prowazekii)、立氏立克次体（R.brasiliensis）、Q热立克次体（C.burnetii）、嗜吞噬细胞无形体（A.phagocytophi）及伯氏疏螺旋体（B.burgdorferi）无交叉反应。批内及批间重复性变异系数均小于5%。

特异性试验扩增曲线

重复性实验结果

五、结果判读

1

质量控制

有效实验应同时满足如下条件：

—— 阳性对照有扩增曲线，且Ct值≤35；

—— 阴性对照及空白对照无Ct值，或Ct值≥40，且无扩增曲线。

2

阴性结果

在有效实验条件下，待检样品Ct值≥40，且无典型扩增曲线，判为阴性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性（实时荧光PCR法）。

3

阳性结果

在有效实验条件下，阳性结果判断及报告如下：

—— 待检样品Ct值≤35，且出现典型扩增曲线，判为阳性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性（实时荧光PCR法）；

—— 如待检样品35＜Ct值≤40，且出现典型扩增曲线，需要复检，复检后Ct值仍在35~40之间，且出现典型扩增曲线，判为阳性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性（实时荧光PCR法）。否则判为阴性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性（实时荧光PCR法）；

—— 如待检样品40＜Ct值≤45，且出现扩增曲线，建议采用浓缩方式处理核酸样品后复检，复检后Ct值有明显减小趋势，且扩增曲线有典型对数增长期，判为阳性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阳性（实时荧光PCR法），此类样品建议采用其他检测方法进行确认。否则判为阴性，报告为待检样品恙虫病东方体核酸阴性（实时荧光PCR法）。

六、生物安全及防污染要求

生物安全应遵循GB 19489和WS 233 中相关规定，本方法中恙虫病东方体实时荧光PCR检测应在生物安全2级（BSL-2）实验室内进行；PCR防污染要求应遵循WS/T 230中相关规定。